微流控生物反應(yīng)器內(nèi)的真菌代謝物篩選

作為無(wú)柄生物，植物不能輕易通過(guò)搬遷來(lái)規(guī)避壓力源。為了評(píng)估所經(jīng)歷的非生物和生物脅迫的質(zhì)量和數(shù)量，植物已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的信號(hào)通路。通常，屬于潛在病原體的分子是在植物質(zhì)膜的水平上被識(shí)別出來(lái)的。識(shí)別后，信號(hào)從細(xì)胞外部傳遞到細(xì)胞中，最終誘導(dǎo)防御反應(yīng)（如果可能的話）。在病原體觸發(fā)免疫 （PTI） 中，一種基礎(chǔ)防御反應(yīng)，信號(hào)通常在二級(jí)信使 Ca 的幫助下傳遞2+.細(xì)胞外間隙含有相對(duì)高濃度的 Ca2+，尤其是與細(xì)胞質(zhì)中的濃度并列時(shí)。為了對(duì)病原體的存在做出反應(yīng)，Ca2+離子被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)錄因子的幫助下改變細(xì)胞的行為。這個(gè) Ca 的導(dǎo)入2+與 H 跨質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)一起發(fā)生。質(zhì)子的轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致細(xì)胞外 pH 值的變化，這很容易量化。pH 值變化是評(píng)估植物是否發(fā)生 PTI 反應(yīng)的常用讀數(shù)。

為了快速連續(xù)篩選多種真菌代謝物的免疫活性，需要一個(gè)簡(jiǎn)單可靠的系統(tǒng)來(lái)測(cè)量微流體生物反應(yīng)器 （MBR） 中的 pH 值變化，該系統(tǒng)由 KIT 微結(jié)構(gòu)技術(shù)研究所 （IMT） 與 KIT 植物研究所合作開(kāi)發(fā)。因此，設(shè)計(jì)了一個(gè)從 PreSens pH-1 SMA HP5 到 MBR 中相應(yīng)傳感器點(diǎn) SP-HP5的可伸縮但可密封的連接器，并在機(jī)械和生物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了檢查。MBR 是一種用于培養(yǎng)植物細(xì)胞的雙室生物反應(yīng)器（見(jiàn)圖 1A）。透膜將培養(yǎng)室和營(yíng)養(yǎng)流室隔開(kāi)。它最初是由 IMT 的 Tim Finkbeiner 設(shè)計(jì)的，然后進(jìn)一步發(fā)展。細(xì)胞可以通過(guò)橢圓形腔室兩端的兩個(gè)開(kāi)口帶入培養(yǎng)室。開(kāi)口配有 M5 螺紋，以便用合適的螺釘密封。MBR 可以通過(guò)單向流連接到更多的 MBR。因此，留在培養(yǎng)室中的細(xì)胞持續(xù)獲得來(lái)自先前 MBR 的新鮮培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物，同時(shí)它們自身的代謝產(chǎn)物被運(yùn)輸?shù)较乱粋€(gè) MBR 并帶走廢物?；驹硎瞧饰黾?xì)胞間通訊通路，通過(guò)每個(gè) MBR 培養(yǎng)一種細(xì)胞來(lái)獲取有關(guān)所涉及的過(guò)程和反應(yīng)的信息。在 MBR 的培養(yǎng)室中培養(yǎng) Nicotiana tabacum 的 BY2 系細(xì)胞時(shí)，通過(guò) pH-1 SMA HP5 定量 pH 值?？梢詫⒁u(píng)估免疫活性的物質(zhì)添加到供應(yīng)給細(xì)胞的培養(yǎng)基中。如果可以觀察到 pH 值的增加，則可以將其解釋為目標(biāo)物質(zhì)免疫活性的第一個(gè)跡象。

圖 1：微流控生物反應(yīng)器 （MBR）：A） MBR 的頂視圖和側(cè)視圖示意圖。它由兩個(gè)腔室組成，由半透膜隔開(kāi)，僅允許介質(zhì)和溶劑通過(guò)。B） MBR 和傳感器的設(shè)置：傳感器點(diǎn) SP-HP5 通過(guò)一個(gè)連接器安裝，該連接器擰入培養(yǎng)室兩個(gè)螺紋開(kāi)口的右側(cè)（在這種情況下，第二個(gè)開(kāi)口覆蓋有 851 型 3M 聚酯膠帶）。傳感器點(diǎn)通過(guò)玻璃纖維連接到測(cè)量設(shè)備 pH-1 SMA HP5 上。

結(jié)論

從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和不同的設(shè)計(jì)中，我們得出結(jié)論，通過(guò)不同連接器設(shè)計(jì)的透光率似乎并沒(méi)有顯著影響測(cè)量。然而，與通過(guò)玻璃燒杯進(jìn)行的參考測(cè)量相比，聚合物連接器測(cè)得的 pH 值似乎發(fā)生了變化。由于玻璃是傳感器指南中規(guī)定的適當(dāng)反應(yīng)器材料，因此可能需要進(jìn)行特殊校準(zhǔn)來(lái)應(yīng)對(duì)玻璃中的光折射，這會(huì)導(dǎo)致使用聚合物時(shí)測(cè)量值發(fā)生變化。如果這種變化可以得到驗(yàn)證 - 可能通過(guò)更多和不同的設(shè)置測(cè)試 - 并且考慮到 pH-1 SMA HP5 傳感器的相應(yīng)位置將適合測(cè)量我們 MBR 中的 pH 值。

在之前的實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)使用使用電極的臺(tái)式 pH 計(jì)測(cè)量 pH 值，證實(shí)了 25 μg/mL 殼聚糖會(huì)導(dǎo)致 BY2 細(xì)胞中細(xì)胞外 pH 值升高。使用相同的處理，這項(xiàng)工作旨在證明 MBR 和 pH-1 SMA HP5 系統(tǒng)的組合可用于觀察與免疫反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞外 pH 值增加。開(kāi)始處理后，15 分鐘后觀察到 pH 值顯著升高。這種延遲可以通過(guò)處理后的 MS 需要泵入 MBR 的時(shí)間來(lái)解釋。觀察到的 pH 值變化表明該方法可用于篩選植物細(xì)胞上物質(zhì)的免疫活性。通過(guò)使用多個(gè)通道和傳感器點(diǎn)，將有可能建立高通量 篩選方法。此外，我們研究了由于腔室的橢圓形，MBR 培養(yǎng)室中營(yíng)養(yǎng)梯度的發(fā)展。關(guān)于此評(píng)估，在更大區(qū)域（例如，使用 VisiSens 系統(tǒng)）中分析 pH 值將很有趣。然而，傳感器箔必須打孔，營(yíng)養(yǎng)流才能到達(dá)培養(yǎng)室，并且必須建立傳感器箔的安裝過(guò)程。